Հիմնական տարբերություն – Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
ԴՆԹ-ի հաջորդականությունը շատ կարևոր է ԴՆԹ-ի վերլուծության համար, քանի որ ԴՆԹ-ի որոշակի շրջանի վրա նուկլեոտիդների ճիշտ դասավորության մասին իմացությունը բացահայտում է դրա մասին շատ կարևոր տեղեկություններ: Կան ԴՆԹ-ի հաջորդականության տարբեր մեթոդներ: Sanger sequencing-ը և Pyrosequencing-ը ԴՆԹ-ի հաջորդականության երկու տարբեր մեթոդներ են, որոնք լայնորեն օգտագործվում են մոլեկուլային կենսաբանության մեջ: Sanger հաջորդականության և պիրոսեքվենցիայի հիմնական տարբերությունն այն է, որ Sanger-ի հաջորդականությունը օգտագործում է դիդեօքսինուկլեոտիդներ՝ դադարեցնելու ԴՆԹ-ի սինթեզը՝ նուկլեոտիդային հաջորդականությունը կարդալու համար, մինչդեռ պիրոսեքվենցիան հայտնաբերում է պիրոֆոսֆատի արտազատումը՝ ներառելով նուկլեոտիդները և սինթեզելով ընթերցման ճշգրիտ հաջորդականությունը:
Ի՞նչ է Sanger Sequencing?
Sanger հաջորդականությունը ԴՆԹ-ի հաջորդականացման առաջին սերնդի մեթոդ է, որը մշակվել է Ֆրեդերիկ Սանգերի և նրա քոլեջների կողմից 1977 թվականին: Այն նաև հայտնի է որպես շղթայի ավարտման հաջորդականություն կամ դիդեօքսի հաջորդականություն, քանի որ այն հիմնված է դիդեօքսինուկլեոտիդների (ddNTPs) կողմից շղթայի դադարեցման վրա: Այս մեթոդը լայնորեն կիրառվում էր ավելի քան 30 տարի, մինչև ստեղծվեց Նոր սերնդի հաջորդականությունը (NGS): Սանգերի հաջորդականության տեխնիկան հնարավորություն տվեց հայտնաբերել նուկլեոտիդների ճիշտ կարգը կամ ԴՆԹ-ի որոշակի հատվածի կցումը: Այն հիմնված է ddNTP-ների ընտրովի ընդգրկման և ԴՆԹ-ի սինթեզի դադարեցման վրա in vitro ԴՆԹ-ի վերարտադրման ժամանակ: Հարակից նուկլեոտիդների միջև ֆոսֆոդիստերային կապի ձևավորումը շարունակելու համար 3' OH խմբերի բացակայությունը ddNTP-ների եզակի առանձնահատկությունն է: Հետևաբար, երբ ddNTP-ը կցվում է, շղթայի երկարացումը դադարում է և ավարտվում այդ կետից: Կան չորս ddNTP՝ ddATP, ddCTP, ddGTP և ddTTP, որոնք օգտագործվում են Sanger հաջորդականության մեջ: Այս նուկլեոտիդները դադարեցնում են ԴՆԹ-ի վերարտադրության գործընթացը, երբ դրանք ներառվում են ԴՆԹ-ի աճող շղթայի մեջ և հանգեցնում են տարբեր երկարությունների կարճ ԴՆԹ-ի:Մազանոթային գելային էլեկտրոֆորեզն օգտագործվում է ԴՆԹ-ի այս կարճ շղթաները ըստ իրենց չափերի գելի վրա կազմակերպելու համար, ինչպես ցույց է տրված Նկար 01-ում:
Նկար 1. սինթեզված կարճ ԴՆԹ-ի մազանոթ գելային էլեկտրոֆորեզ
ԴՆԹ-ի in vitro վերարտադրության համար պետք է ներկայացվեն մի քանի պահանջներ: Դրանք են ԴՆԹ պոլիմերազային ֆերմենտը, կաղապարային ԴՆԹ-ն, օլիգոնուկլեոտիդային պրայմերները և դեզօքսինուկլեոտիդները (dNTPs): Sanger հաջորդականության դեպքում ԴՆԹ-ի վերարտադրությունը կատարվում է չորս առանձին փորձանոթներում, ինչպես նաև ddNTP-ների չորս տեսակները առանձին: Դեզօքսինուկլեոտիդները ամբողջությամբ չեն փոխարինվում համապատասխան ddNTP-ներով: Հատուկ dNTP-ի խառնուրդը (օրինակ՝ dATP + ddATP) ներառված է խողովակի մեջ և կրկնօրինակվում է: Չորս առանձին խողովակային արտադրանք գելի վրա աշխատում են չորս առանձին հորերում: Այնուհետև կարդալով գելը, հաջորդականությունը կարող է կառուցվել, ինչպես ցույց է տրված Նկար 02-ում:
Նկար 02. Սանգերի հաջորդականություն
Sanger հաջորդականությունը կարևոր տեխնիկա է, որն օգնում է մոլեկուլային կենսաբանության բազմաթիվ ոլորտներում: Մարդու գենոմի նախագիծը հաջողությամբ ավարտվեց Sanger-ի հաջորդականության վրա հիմնված մեթոդների օգնությամբ: Sanger-ի հաջորդականությունը նաև օգտակար է թիրախային ԴՆԹ-ի հաջորդականացման, քաղցկեղի և գենետիկական հիվանդությունների հետազոտության, գեների արտահայտման վերլուծության, մարդու նույնականացման, պաթոգենների հայտնաբերման, մանրէների հաջորդականության և այլնի համար:
Կան Sanger հաջորդականության մի քանի թերություններ.
- Հերթականացվող ԴՆԹ-ի երկարությունը չի կարող ավելի երկար լինել 1000 բազային զույգից
- Միայն մեկ շղթա կարելի է հաջորդականացնել միաժամանակ։
- Գործընթացը ժամանակատար և թանկ է:
Հետևաբար, այս խնդիրները հաղթահարելու համար ժամանակի ընթացքում մշակվեցին նոր առաջադեմ հաջորդականության տեխնիկա: Այնուամենայնիվ, Sanger հաջորդականությունը դեռ օգտագործվում է իր բարձր ճշգրիտ արդյունքների շնորհիվ մինչև մոտավորապես 850 բազային զույգ երկարության բեկորներ:
Ի՞նչ է պիրոսեքվենցիան:
Պիրոսեքվենցիան ԴՆԹ-ի հաջորդականացման նոր տեխնիկա է, որը հիմնված է «սինթեզով հաջորդականության» վրա: Այս տեխնիկան հիմնված է նուկլեոտիդների ընդգրկման վրա պիրոֆոսֆատի արտազատման հայտնաբերման վրա: Գործընթացն օգտագործվում է չորս տարբեր ֆերմենտների կողմից՝ ԴՆԹ պոլիմերս, ATP սուլֆուրիլազ, լյուցիֆերազ և ապիրազ, և երկու սուբստրատներ՝ ադենոզին 5' ֆոսֆոսուլֆատ (APS) և լյուցիֆերին:
Գործընթացը սկսվում է այն բանից, որ այբբենարանը կապվում է միաշղթա ԴՆԹ կաղապարի հետ, իսկ ԴՆԹ պոլիմերազը սկսում է դրան լրացնող նուկլեոտիդների ընդգրկումը: Երբ նուկլեոտիդները միանում են (նուկլեինաթթվի պոլիմերացում), այն արձակում է պիրոֆոսֆատ (երկու ֆոսֆատ խմբեր, որոնք կապված են իրար) և էներգիա։Յուրաքանչյուր նուկլեոտիդային հավելում արձակում է պիրոֆոսֆատի համաչափ քանակություն: Պիրոֆոսֆատը փոխակերպվում է ATP-ի ATP սուլֆուրիլազի միջոցով՝ սուբստրատի APS-ի առկայության դեպքում: Ստեղծված ATP-ն խթանում է լյուցիֆերազի միջնորդավորված փոխակերպումը լյուցիֆերինի օքսիլյուցիֆերինի` արտադրելով տեսանելի լույս այնպիսի քանակությամբ, որը համաչափ է ATP-ների քանակին: Լույսը հայտնաբերվում է ֆոտոնների հայտնաբերման սարքի կամ ֆոտոբազմապատկիչի միջոցով և ստեղծում է պիրոգրամ: Apyrase-ը քայքայում է ATP-ն և չներառված dNTP-ները ռեակցիայի խառնուրդում: dNTP-ի ավելացումը կատարվում է մեկ անգամ: Քանի որ նուկլեոտիդի ավելացումը հայտնի է ըստ լույսի ընդգրկման և հայտնաբերման, կարելի է որոշել կաղապարի հաջորդականությունը: Պիրոգրամն օգտագործվում է նմուշի ԴՆԹ-ի նուկլեոտիդային հաջորդականությունը ստեղծելու համար, ինչպես ցույց է տրված Նկար 03-ում:
Պիրոսեքվենցիան շատ կարևոր է մեկ նուկլեոտիդային պոլիմորֆիզմի վերլուծության և ԴՆԹ-ի կարճ հատվածների հաջորդականության մեջ: Բարձր ճշգրտությունը, ճկունությունը, ավտոմատացման հեշտությունը և զուգահեռ մշակումը pyrosequencing-ի առավելություններն են Sanger հաջորդականության տեխնիկայի նկատմամբ:
Նկար 03. Պիրոսհաջորդականություն
Ո՞րն է տարբերությունը Sanger Sequencing-ի և Pyrosequencing-ի միջև:
Sanger Sequencing vs Pyrosequencing |
|
| Sanger հաջորդականությունը ԴՆԹ-ի հաջորդականացման մեթոդ է, որը հիմնված է ddNTP-ների ընտրովի միավորման վրա ԴՆԹ պոլիմերազի և շղթայի ավարտման միջոցով: | Pyrosequencing-ը ԴՆԹ-ի հաջորդականացման մեթոդ է, որը հիմնված է նուկլեոտիդի ներկառուցման արդյունքում պիրոֆոսֆատի արտազատման հայտնաբերման վրա: |
| ddNTP-ի օգտագործում | |
| ddNTP-ներն օգտագործվում են ԴՆԹ-ի վերարտադրությունը դադարեցնելու համար | ddNTP-ները չեն օգտագործվում: |
| Ֆերմենտներ ներգրավված | |
| Օգտագործվում է ԴՆԹ պոլիմերազ: | Օգտագործվում են չորս ֆերմենտներ՝ ԴՆԹ պոլիմերազ, ATP սուլֆուրիլազ, Լյուցիֆերազ և Ապիրազ: |
| Օգտագործված ենթաշերտեր | |
| APS-ը և Luciferin-ը չեն օգտագործվում: | Օգտագործվում են Ադենոզին 5' ֆոսֆոսուլֆատ (APS) և լյուցիֆերին: |
| Առավելագույն ջերմաստիճան | |
| Սա դանդաղ գործընթաց է: | Սա արագ գործընթաց է: |
Ամփոփում – Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
Sanger հաջորդականությունը և Պիրոսեքվենցիան ԴՆԹ-ի հաջորդականացման երկու մեթոդներ են, որոնք օգտագործվում են մոլեկուլային կենսաբանության մեջ: Սանգերի հաջորդականությունը կառուցում է նուկլեոտիդների հերթականությունը՝ վերջացնելով շղթայի երկարացումը, մինչդեռ պիրոսեքվենցիան կառուցում է նուկլեոտիդների ճշգրիտ հաջորդականությունը՝ նուկլեոտիդների ընդգրկմամբ և պիրոֆոսֆատների արտազատումը հայտնաբերելով:Հետևաբար, Sanger հաջորդականության և պիրոսեկուենավորման միջև հիմնական տարբերությունն այն է, որ Sanger հաջորդականությունն աշխատում է հաջորդականության վրա՝ շղթայի ավարտով, մինչդեռ պիրոսեքվենցիան աշխատում է հաջորդականության վրա՝ սինթեզով:
