Հիմնական տարբերություն – Գենի կլոնավորում ընդդեմ PCR
ԴՆԹ-ի շատ պատճենների սինթեզը ԴՆԹ-ի կոնկրետ հատվածից կոչվում է ԴՆԹ-ի ամպլիֆիկացում: Գոյություն ունեն ԴՆԹ-ի ուժեղացման երկու հիմնական գործընթաց՝ գենի կլոնավորում և ՊՇՌ: Գենի կլոնավորման և PCR-ի միջև հիմնական տարբերությունն այն է, որ գենի կլոնավորումն արտադրում է որոշակի գենի բազմաթիվ պատճեններ in vivo՝ կառուցելով ռեկոմբինանտ ԴՆԹ և աճելով հյուրընկալող բակտերիաի ներսում, մինչդեռ PCR-ն արտադրում է հատուկ ԴՆԹ-ի հատվածի միլիոնավոր պատճեններ in vitro՝ անցնելով կրկնվող ցիկլեր: դենատուրացիա և սինթեզ։
Ի՞նչ է գեների կլոնավորումը:
Գենի կլոնավորումը տեխնիկա է, որն օգտագործվում է օրգանիզմի գենոմային ԴՆԹ-ից հատուկ գենը հայտնաբերելու և բազմացնելու համար՝ ռեկոմբինանտ ԴՆԹ-ի կառուցման միջոցով:Գենոմային ԴՆԹ-ն պարունակում է հազարավոր տարբեր գեներ, որոնք կոդավորված են սպիտակուցների համար: Երբ ԴՆԹ-ն արդյունահանվում է, այն ներառում է բոլոր հնարավոր գեները, որոնք կարող են կրել: Գենի կլոնավորման տեխնիկան հնարավորություն է տվել ընդհանուր ԴՆԹ-ից կոնկրետ գեն հայտնաբերել: Հետևաբար գեների կլոնավորումը կարևոր գործիք է մոլեկուլային կենսաբանության մեջ:
Օրգանիզմի գենոմային գրադարանի ստեղծումը էական է գեների կլոնավորման համար, եթե չկա որևէ տեղեկություն ԴՆԹ-ում համապատասխան գենի գտնվելու վայրի մասին: Գենոմային գրադարանը պատրաստվում է հետևյալ քայլերով։
Քայլ 1. Ընդհանուր ԴՆԹ-ի դուրսբերում օրգանիզմից, որը պարունակում է ցանկալի գեն:
Քայլ 2. Արդյունահանված ԴՆԹ-ի մարսողության սահմանափակում՝ փոքր կառավարելի բեկորներ ստանալու համար: Այս քայլին նպաստում են սահմանափակող էնդոնուկլեազները։
Քայլ 3. Հարմար վեկտորի ընտրություն և վեկտորի ԴՆԹ-ի բացում՝ օգտագործելով նույն սահմանափակող էնդոնուկլեազները: Բակտերիալ պլազմիդները սովորաբար օգտագործվում են որպես օտար ԴՆԹ կրելու վեկտորներ: Պլազմիդները ԴՆԹ-ի փոքր շրջանակներ են, որոնք տեղակայված են բակտերիաների ներսում:
Քայլ 4. Վեկտորի ԴՆԹ-ի և մասնատված ԴՆԹ-ի միացում՝ ԴՆԹ-ի ռեկոմբինանտ մոլեկուլ արտադրելու համար: Այս քայլը կառավարվում է ԴՆԹ լիգազի միջոցով:
Քայլ 5. ԴՆԹ-ի ռեկոմբինանտ մոլեկուլների տեղափոխում հյուրընկալող բակտերիաների մեջ: Այս քայլը հայտնի է որպես փոխակերպում և կատարվում է ջերմային ցնցումների միջոցով:
Քայլ 5. Փոխակերպված բակտերիաների բջիջների զննում կուլտուրայի միջավայրում: Փոխակերպման գործընթացի վերջում ստացվում է փոխակերպված և չփոխակերպված հյուրընկալող բջիջների խառը պոպուլյացիան: Որպես հետաքրքրության գեն ներառում է միայն փոխակերպված հյուրընկալող բջիջները: Այսպիսով, անհրաժեշտ է ընտրել փոխակերպված բջիջները: Ընտրությունը կատարվում է հակաբիոտիկներ պարունակող սելեկտիվ միջավայրերի միջոցով: Այս զննման միջավայրում աճում են միայն փոխակերպված բջիջները՝ հնարավորություն տալով ընտրություն կատարել:
Քայլ 6. բակտերիաների աճեցում՝ գեների գրադարան ստեղծելու համար: Այս քայլում փոխակերպված հյուրընկալող բջիջները ներմուծվում են թարմ կուլտուրայի միջավայր, որն ապահովում է աճի օպտիմալ պահանջներ: Մշակույթի թիթեղների վրա գտնվող ընդհանուր գաղութները ներկայացնում են այդ օրգանիզմի գենոմային գրադարանը:
Քայլ 7. Հետաքրքրվող գենը պարունակող ԴՆԹ-ի ռեկոմբինանտ մոլեկուլը պետք է զննվի ռեկոմբինանտ ԴՆԹ-ի հազարավոր կլոնավորված բեկորներից: Այն կարող է իրականացվել զոնդերի օգտագործմամբ, որոնք նշում են հատուկ գենը կամ այդ գենից ստացված հատուկ սպիտակուցը:
Երբ բակտերիաների գաղութը պարունակող հետաքրքրված գենը հայտնաբերվի ընդհանուր գաղութներից, հնարավոր կլինի ստեղծել գենը պարունակող ռեկոմբինանտ պլազմիդի միլիոնավոր օրինակներ:
Գենային կլոնավորումն օգտագործվում է գենային գրադարաններ ստեղծելու, հատուկ սպիտակուցներ, վիտամիններ, հակաբիոտիկներ, հորմոններ արտադրելու, օրգանիզմների գենոմների հաջորդականացման և քարտեզագրման, դատաբժշկական փորձագիտությունում անհատների ԴՆԹ-ի բազմաթիվ պատճենների ստեղծման և այլն:
Գծապատկեր_1. Գենի կլոնավորում
Ի՞նչ է PCR?
Պոլիմերազային շղթայական ռեակցիան (PCR) մեթոդ է, որը ստեղծում է որոշակի ԴՆԹ-ի հատվածի մեծ թվով պատճեններ: Հատուկ ԴՆԹ-ի հաջորդականության էքսպոնենցիալ ուժեղացումն ստացվում է PCR-ով in vitro պայմաններում: Այս տեխնիկան շատ հզոր գործիք է մոլեկուլային կենսաբանության մեջ, քանի որ այն կարող է բազմապատկել ԴՆԹ-ի փոքր նմուշը օգտագործելի քանակությամբ: PCR-ն ներդրվել է Կարի Մալիսի կողմից 1983 թվականին, և այս մրցանակակիր գյուտը հսկայական առաջընթաց է ստեղծել մոլեկուլային կենսաբանության մեջ:
PCR տեխնիկան հետևում է կրկնվող PCR ռեակցիաներին, ինչպես ցույց է տրված Նկար 02-ում: Մեկ PCR ռեակցիան բաղկացած է երեք հիմնական փուլից, որոնք տեղի են ունենում երեք տարբեր ջերմաստիճաններում. ԴՆԹ-ի կրկնակի շղթաների դենատուրացիա 94 0C-ում, պրայմերների կռում 68 0C և շղթայի երկարացում 72 0 C. Հետևաբար, երբ կատարվում է PCR, ջերմաստիճանի տատանումները պետք է բարձր պահպանվեն պատշաճ վերարտադրության համար: ՊՇՌ-ն իրականացվում է ՊՇՌ մեքենայում՝ ՊՇՌ խողովակների ներսում: PCR խողովակները բեռնված են ճիշտ PCR խառնուրդներով, որոնք պարունակում են կաղապարային ԴՆԹ, Taq պոլիմերազ, պրայմերներ, dNTPs և բուֆեր:Կրկնաշղթա նմուշի ԴՆԹ-ի դենատուրացումը միաշղթա ԴՆԹ-ի կատարվում է կոմպլեմենտար հիմքերի միջև ջրածնային կապերը կոտրելով 94 – 98 0C ջերմաստիճանում: Այնուհետև կաղապարային ԴՆԹ-ի առանձին շղթաները ենթարկվում են այբբենարանների համար: Պետք է տրամադրվի մի զույգ այբբենարան (առաջ և հետադարձ), և դրանք պետք է լինեն ջերմակայուն՝ բարձր ջերմաստիճանը հանդուրժելու համար: Պրայմերները միաշղթա կարճ ԴՆԹ-ի հաջորդականություններ են, որոնք լրացնում են թիրախ ԴՆԹ-ի հատվածի ծայրերը: ՊՇՌ-ում օգտագործվում են սինթետիկ պրայմերներ: Պրայմերները կապվում են նմուշի ԴՆԹ-ի լրացուցիչ հիմքերի հետ և սկսում են նոր շղթայի սինթեզը: Այս քայլը կատալիզացվում է Taq պոլիմերազ կոչվող ֆերմենտի կողմից; ջերմակայուն ԴՆԹ պոլիմերազային ֆերմենտ, որը մեկուսացված է Thermus auqaticus-ից: Երբ առկա են պրայմերներ և նուկլեոտիդներ (շինանյութեր), Taq պոլիմերազը կառուցում է ԴՆԹ-ի նոր շղթան, որը լրացնում է ԴՆԹ-ի ձևանմուշը: PCR ծրագրի վերջում նկատվում է ամպլիֆիկացված ԴՆԹ-ի հատված՝ օգտագործելով գելային էլեկտրոֆորեզ: Եթե լրացուցիչ վերլուծություն է պահանջվում, PCR արտադրանքը մաքրվում է գելից:
PCR-ն շատ օգտակար է գենետիկական և ձեռքբերովի հիվանդությունների ախտորոշման և մոնիտորինգի, հանցագործների նույնականացման (դատաբժշկական ոլորտում), ԴՆԹ-ի թիրախավորված հատվածի կառուցվածքի և գործառույթի ուսումնասիրման, օրգանիզմների գենոմների հաջորդականացման և քարտեզագրման համար, և այլն: PCR-ը դարձել է սովորական լաբորատոր տեխնիկա բժշկական և մոլեկուլային կենսաբանության գիտահետազոտական լաբորատորիաներում գիտնականների շրջանում, քանի որ այն ունի լայն կիրառություն:
Նկար_2. պոլիմերազային շղթայական ռեակցիա
Ո՞րն է տարբերությունը Gene Cloning-ի և PCR-ի միջև:
Գենի կլոնավորում ընդդեմ PCR |
|
| Գենի կլոնավորումն իրենից ներկայացնում է հատուկ գենի բազմաթիվ պատճեններ in vivo ռեկոմբինանտ ԴՆԹ-ի միջոցով ստեղծելու և հյուրընկալող բակտերիա վերածելու գործընթաց: | PCR տեխնիկան արտադրում է որոշակի ԴՆԹ հաջորդականության բազմաթիվ պատճեններ in vitro ՊՇՌ ռեակցիաների կրկնվող ցիկլերի միջոցով: |
| Ռեկոմբինանտ ԴՆԹ-ի կառուցման պահանջ | |
| Ռեկոմբինանտ ԴՆԹ-ն արտադրվում է գենը գտնելու համար: | Ռեկոմբինանտ ԴՆԹ չի արտադրվում։ |
| Աշխատանքի կարիք | |
| Այս գործընթացը աշխատատար է։ | ինտենսիվ աշխատանք չի պահանջվում։ |
| In vivo կամ In vitro գործընթաց | |
| Ռեկոմբինանտ ԴՆԹ-ի կառուցումը in vitro է, իսկ ԴՆԹ-ի ուժեղացումը in vivo է: | ԴՆԹ-ի ուժեղացումը տեղի է ունենում ամբողջությամբ in vitro: |
Ամփոփում – Գենի կլոնավորում ընդդեմ PCR
Գենի կլոնավորումը և ՊՇՌ-ն ԴՆԹ-ի ուժեղացման համար օգտագործվող երկու մեթոդներ են: ՊՇՌ-ն in vitro գործընթաց է, որը ստեղծում է ԴՆԹ-ի մի քանի պատճեններ որոշակի ԴՆԹ-ի հատվածի առանց ռեկոմբինանտ ԴՆԹ-ի և ընդունող օրգանիզմի օգտագործման: Գենի կլոնավորումը հիմնականում in vivo գործընթաց է, որը հանգեցնում է հյուրընկալող օրգանիզմի ներսում հետաքրքրված գենի բազմաթիվ պատճենների՝ ռեկոմբինանտ ԴՆԹ-ի կառուցման միջոցով: Սա է տարբերությունը գեների կլոնավորման և PCR-ի միջև:
