Հիմնական տարբերություն – RT PCR ընդդեմ QPCR
Պոլիմերազային շղթայական ռեակցիան մեթոդ է, որն օգտագործվում է ԴՆԹ-ի որոշակի շրջանի in vitro ուժեղացման համար: 1983 թվականին Կարի Մալիսի կողմից այս տեխնիկայի հայտնագործման շնորհիվ գիտնականները կարող են հետազոտական նպատակներով ԴՆԹ-ի հատուկ բեկորների հազարից միլիոնավոր պատճեններ պատրաստել: Ներկայումս այն դարձել է կլինիկական և հետազոտական լաբորատորիաներում սովորական և կանոնավոր կերպով կատարվող տեխնիկա՝ լայն կիրառությունների համար: Կան ավանդական PCR տեխնիկայի տատանումներ, ինչպիսիք են RT PCR, nested PCR, multiplex PCR, Q PCR, RT – QPCR և այլն: RT PCR և Q PCR-ը PCR-ի երկու կարևոր տարբերակ են: RT PCR-ի և Q PCR-ի հիմնական տարբերությունն այն է, որ RT PCR-ն օգտագործվում է գեների արտահայտությունը հայտնաբերելու համար՝ ՌՆԹ-ից լրացուցիչ ԴՆԹ (cDNA) տառադարձումներ ստեղծելու միջոցով, մինչդեռ Q PCR-ն օգտագործվում է քանակականորեն չափելու PCR արտադրանքները իրական ժամանակում՝ օգտագործելով լյումինեսցենտային ներկեր:
Ի՞նչ է RT PCR:
Հակադարձ տրանսկրիպցիոն պոլիմերազային շղթայական ռեակցիան (RT PCR) PCR-ի տարբերակ է, որն օգտագործվում է ՌՆԹ-ի արտահայտումը հայտնաբերելու համար: Այն շատ կարևոր մեթոդ է հյուսվածքներում mRNA էքսպրեսիան հայտնաբերելու համար։ RT PCR-ն օգտագործվում է, երբ նմուշի սկզբնական նյութը ՌՆԹ է: RT PCR-ում կաղապարի mRNA-ն առաջին հերթին փոխակերպվում է կոմպլեմենտար ԴՆԹ-ի: Այս քայլը կատալիզացվում է հակադարձ տրանսկրիպտազ ֆերմենտի կողմից և գործընթացը հայտնի է որպես հակադարձ տրանսկրիպցիա: Երկրորդ, ավանդական PCR-ն օգտագործվում է նոր սինթեզված cDNA-ի համար՝ ուժեղացման համար:
RT PCR-ը խիստ զգայուն տեխնիկա է, որը պահանջում է համեմատաբար փոքր քանակությամբ ՌՆԹ նմուշ: RT PCR-ն սովորաբար օգտագործվում է ՌՆԹ տեսակների, հատկապես ՌՆԹ վիրուսների, ինչպիսիք են մարդու իմունային անբավարարության վիրուսը և հեպատիտ C-ի վիրուսը, ախտորոշման և քանակականացման համար:
Նկար 01. RT PCR տեխնիկա
Ի՞նչ է QPCR?
Քանակական ՊՇՌ (QPCR) ՊՇՌ-ի տարբերակ է, որն օգտագործվում է ՊՇՌ արտադրանքները քանակապես չափելու համար: Այն նաև կոչվում է իրական ժամանակի պոլիմերազային շղթայական ռեակցիա, քանի որ այն չափում է իրական ժամանակի ուժեղացումը իրական ժամանակի PCR մեքենայի միջոցով: Այն հարմար մեթոդ է նմուշում առկա թիրախային հաջորդականության կամ գենի քանակությունը որոշելու համար: QPCR-ի հետաքրքիր առանձնահատկությունն այն է, որ այն համատեղում է ինչպես ուժեղացումը, այնպես էլ իրական քանակականացումը մեկ քայլի մեջ: Հետևաբար, հայտնաբերման ժամանակ գելային էլեկտրոֆորեզի անհրաժեշտությունը կարող է վերացվել QPCR տեխնիկայի միջոցով: QPCR-ն օգտագործում է լյումինեսցենտային ներկանյութեր՝ PCR-ի արտադրանքները պիտակավորելու համար PCR ռեակցիաների ժամանակ, որոնք ի վերջո հանգեցնում են ուղղակի քանակականացման: Երբ PCR արտադրանքները կուտակվում են, լյումինեսցենտային ազդանշանները նույնպես կուտակվում են, և այն կչափվի իրական ժամանակի մեքենայի միջոցով: QPCR-ն կարող է զուգակցվել RT PCR-ի հետ: Այն հայտնի է որպես RT – QPCR կամ QRT – PCR և համարվում է բջիջներում կամ հյուսվածքներում ՌՆԹ մակարդակների հայտնաբերման ամենահզոր, զգայուն և քանակական մեթոդ:
SYBR Green-ը և Taqman-ը երկու մեթոդներ են, որոնք օգտագործվում են իրական ժամանակում PCR-ի ուժեղացման գործընթացը հայտնաբերելու կամ դիտելու համար: SYBR Green մեթոդն իրականացվում է SYBR green կոչվող լյումինեսցենտ ներկի միջոցով և հայտնաբերում է ուժեղացումը՝ կապելով ներկը՝ կրկնակի շղթա ունեցող ԴՆԹ արտադրելու միջոցով: Taqman-ն իրականացվում է երկակի պիտակավորված զոնդերի միջոցով և հայտնաբերում է ուժեղացումը Taq պոլիմերազով զոնդի քայքայման և ֆտորոֆորի արտազատման միջոցով, ինչպես ցույց է տրված նկար 02-ում: Երկու մեթոդներն էլ վերահսկում են ուժեղացման գործընթացի առաջընթացը և հաղորդում արտադրանքի քանակը իրական ժամանակում:.
Իրական ժամանակում PCR-ն ունի կիրառությունների լայն տեսականի, ինչպիսիք են գեների արտահայտման քանակականացումը, միկրոՌՆԹ-ի և ոչ կոդավորող ՌՆԹ-ի վերլուծությունը, SNP-ի գենոտիպավորումը, պատճենների թվի տարբերակների հայտնաբերումը, հազվագյուտ մուտացիաների հայտնաբերումը, գենետիկորեն ձևափոխված օրգանիզմների հայտնաբերումը, վարակիչ նյութերի հայտնաբերումը: և այլն։
Նկար 02. Քանակական PCR տեխնիկա
Ո՞րն է տարբերությունը RT PCR-ի և QPCR-ի միջև:
RT PCR ընդդեմ QPCR |
|
| RT PCR-ը տեխնիկա է, որն օգտագործվում է ուժեղացման միջոցով գեների արտահայտությունը հայտնաբերելու համար: | QPCR-ն տեխնիկա է, որն ուժեղացնում է ԴՆԹ-ն և քանակականացնում է PCR արտադրանքը իրական ժամանակում: |
| Հակադարձ տրանսկրիպտազային ֆերմենտի ներգրավում | |
| Ֆերմենտային հակադարձ տրանսկրիպտազը օգտագործվում է RT PCR-ի համար: | Ֆերմենտային հակադարձ տրանսկրիպտազը չի օգտագործվում QPCR-ի համար: |
| Ֆլուորեսցենտային պիտակավորված մոլեկուլների օգտագործում | |
| Ֆլուորեսցենտային պիտակավորված ներկերը կամ զոնդերը չեն օգտագործվում RT PCR-ի համար: | Fluorescently պիտակավորված ներկեր կամ զոնդեր օգտագործվում են QPCR-ի համար: |
| PCR արտադրանքի քանակականացում | |
| Եթե զուգակցված չէ QPCR-ի հետ, RT PCR-ը չի չափում PCR արտադրանքը: | QPCR քանակապես չափում է PCR արտադրանքը: |
| Մեկնարկային նյութ | |
| Սկզբնական նյութը mRNA է: | Սկզբնական նյութը ԴՆԹ-ն է։ |
| cDNA-ի սինթեզ | |
| Կոմպլեմենտար ԴՆԹ-ն արտադրվում է RT PCR-ի ժամանակ: | Կոմպլեմենտար ԴՆԹ չի արտադրվում QPCR-ի ժամանակ: |
Ամփոփում – RT PCR ընդդեմ QPCR
RT PCR-ն և QPCR-ն ավանդական PCR-ի երկու տարբերակ են: RT PCR տեխնիկան իրականացվում է mRNA նմուշների համար և այն պայմանավորված է հակադարձ տառադարձմամբ և cDNA-ի արտադրությամբ:QPCR-ն օգտագործվում է PCR արտադրանքները իրական ժամանակում PCR ջերմային ցիկլերի ընթացքում քանակականացնելու համար՝ օգտագործելով լյումինեսցենտային ներկեր կամ պիտակավորված զոնդեր: QPCR-ում PCR արտադրանքի քանակը ներկայացված է նմուշի կողմից արձակված լյումինեսցենտային ազդանշաններով: RT PCR-ն լայնորեն օգտագործվում է որպես ուժեղացման գործընթաց, մինչդեռ QPCR-ն սովորաբար օգտագործվում է որպես քանակական գործընթաց: Սա է տարբերությունը RT PCR-ի և QPCR-ի միջև:
