Պայմանական nested և իրական ժամանակի PCR վերլուծությունների միջև հիմնական տարբերությունն այն է, որ սովորական PCR-ը տեխնիկա է, որը մշակվել է ԴՆԹ-ի հատուկ հաջորդականությունների ընդլայնման համար, իսկ nested PCR-ը սովորական PCR-ի փոփոխություն է, որը բաղկացած է երկու հաջորդական ուժեղացման ռեակցիաներից, մինչդեռ իրական -time PCR-ը սովորական PCR-ի տարբերակ է, որն ի վիճակի է քանակականացնել ուժեղացված արտադրանքը:
PCR-ը շատ տարածված գիտական տեխնիկա է, որը լայնորեն օգտագործվում է հետազոտության և բժշկության մեջ ԴՆԹ-ի հայտնաբերման համար: PCR թեստերն օգտագործվում են անտիգենները հայտնաբերելու համար՝ հայտնաբերելով դրանց ԴՆԹ-ն կամ ՌՆԹ-ն: Ընդհանուր առմամբ, վիրուսային ՌՆԹ-ն առկա է մարմնում՝ նախքան հակամարմիններ հայտնաբերելը կամ հիվանդության ախտանիշները դրսևորելը:PCR թեստը կարող է պարզել՝ ինչ-որ մեկի մոտ վիրուսը վաղ է, թե ոչ: Ներկայումս PCR-ն ստանդարտ թեստ է COVID-19 հիվանդության հայտնաբերման համար։ Գոյություն ունեն PCR տեխնիկայի տարբեր տեսակներ, ինչպիսիք են իրական ժամանակի PCR, nested PCR, multiplex PCR, hot start PCR և երկարաժամկետ PCR և այլն:
Ի՞նչ են սովորական PCR վերլուծությունները:
Պայմանական PCR վերլուծությունը in vitro ԴՆԹ-ի ուժեղացման մեթոդ է, որը սովորաբար իրականացվում է մոլեկուլային կենսաբանական լաբորատորիաներում: Այս մեթոդը հնարավորություն տվեց արտադրել ԴՆԹ-ի որոշակի հատվածի հազարավորից միլիոնավոր պատճեններ: Կարի Մալիսն այս տեխնիկան ներկայացրել է 1980 թվականին: Այս տեխնիկան պահանջում է ԴՆԹ-ի հատված, որը հայտնի է որպես ձևանմուշ՝ դրա բազմաթիվ պատճեններ պատրաստելու համար: Taq պոլիմերազը գործում է որպես ԴՆԹ պոլիմերազային ֆերմենտ և կատալիզացնում է կաղապարի հաջորդականության նոր շղթաների սինթեզը:
PCR խառնուրդի այբբենարանները կգործեն որպես բեկորների ընդլայնման մեկնարկային կետեր: Բոլոր բաղադրիչները, որոնք անհրաժեշտ են ԴՆԹ-ի պատճենները պատրաստելու համար, ներառված են PCR խառնուրդում:PCR ռեակցիան իրականացվում է PCR մեքենայի մեջ, և այն պետք է սնվի ճիշտ PCR խառնուրդով և ճիշտ PCR ծրագրով: Եթե ռեակցիայի խառնուրդը և ծրագիրը ճիշտ են, այն շատ փոքր քանակությամբ ԴՆԹ-ից կստեղծի ԴՆԹ-ի որոշակի հատվածի անհրաժեշտ քանակի պատճեններ։
Նկար 01. Պայմանական PCR վերլուծություն
ՊՇՌ ռեակցիան ներառում է երեք հիմնական փուլ՝ դենատուրացիա, պրայմերային եռացում և թելերի երկարացում: Այս երեք քայլերը տեղի են ունենում երեք տարբեր ջերմաստիճաններում: PCR բուֆերը պահպանում է Taq պոլիմերազի գործողության օպտիմալ պայմանները: PCR ռեակցիայի այս երեք փուլերը կրկնվում են PCR արտադրանքի պահանջվող քանակությունը ստանալու համար: Յուրաքանչյուր PCR ռեակցիայի ժամանակ ԴՆԹ-ի պատճենների թիվը կրկնապատկվում է:Հետևաբար, էքսպոնենցիալ ուժեղացում կարելի է դիտարկել PCR-ում: PCR արտադրանքը կարող է լուծվել գելային էլեկտրոֆորեզի միջոցով, քանի որ այն արտադրում է տեսանելի քանակությամբ ԴՆԹ գելի վրա և այն կարող է մաքրվել հետագա ուսումնասիրությունների համար, ինչպիսիք են հաջորդականությունը:
PCR-ն արժեքավոր գործիք է բժշկական և կենսաբանական հետազոտություններում: Հատկապես դատաբժշկական հետազոտություններում PCR-ն հսկայական արժեք ունի, քանի որ այն կարող է ուժեղացնել ԴՆԹ-ն հանցագործների փոքրիկ նմուշների ուսումնասիրությունների համար և կազմել դատաբժշկական ԴՆԹ պրոֆիլներ: PCR-ն լայնորեն օգտագործվում է մոլեկուլային կենսաբանության բազմաթիվ ոլորտներում, ներառյալ՝ գենոտիպավորումը, գեների կլոնավորումը, մուտացիաների հայտնաբերումը, ԴՆԹ-ի հաջորդականությունը, ԴՆԹ միկրոզանգվածները և հայրության թեստավորումը:
Ի՞նչ են Nested PCR վերլուծությունները:
Nested PCR-ը ՊՇՌ-ի տեսակ է, որը նվազեցնում է ԴՆԹ-ի ոչ սպեցիֆիկ ամպլիֆիկացիան: Գոյություն ունեն երկու հաջորդական PCR կամ երկու հաջորդական ուժեղացման ռեակցիաներ Nested PCR վերլուծության մեջ: Առաջին ուժեղացման ռեակցիայի ժամանակ արտադրվում է PCR արտադրանք: Առաջին ռեակցիայից հետո երկրորդ ուժեղացման ռեակցիա է կատարվում առաջին ռեակցիայի PCR արտադրանքի վրա:Հետևաբար, երկրորդ ռեակցիայի խառնուրդի պրայմերները կապվում են առաջին PCR արտադրանքի հետ և ուժեղացնում այն:
Նկար 02. Nested PCR
Պայմերների զույգերը տարբերվում են յուրաքանչյուր ռեակցիայում: Պրայմերների ոչ սպեցիֆիկ կապը կրճատվում է nested PCR-ում: Nested PCR վերլուծությունները օգտակար են զգայունությունը և/կամ առանձնահատկությունը բարձրացնելու համար: Այնուամենայնիվ, nested PCR-ը պահանջում է գիտելիքներ հետաքրքրված հաջորդականության մասին:
Ի՞նչ են իրական ժամանակի PCR վերլուծությունները:
Իրական ժամանակում PCR կամ քանակական PCR (Q PCR) PCR-ի փոփոխված տարբերակ է, որը չափում է PCR արտադրանքը քանակապես: Հետևաբար, այս տեխնիկան քանակականացնում է ուժեղացումը իրական ժամանակում՝ օգտագործելով իրական ժամանակի PCR մեքենա: Այն նաև հարմար մեթոդ է նմուշում առկա թիրախային հաջորդականության կամ գենի քանակությունը որոշելու համար:
Իրական ժամանակի PCR-ի հետաքրքիր առանձնահատկությունն այն է, որ այն համատեղում է և՛ ուժեղացումը, և՛ իրական քանակականացումը մեկ քայլի մեջ: Հետևաբար, հայտնաբերման համար գելային էլեկտրոֆորեզի անհրաժեշտությունը կարող է վերացվել իրական ժամանակի PCR տեխնիկայի միջոցով: PCR ռեակցիաների ընթացքում PCR-ի արտադրանքը պիտակավորելու համար լյումինեսցենտային ներկերի օգտագործումն ի վերջո կհանգեցնի ուղղակի քանակականացման: Երբ PCR արտադրանքները կուտակվում են, լյումինեսցենտային ազդանշանները նույնպես կուտակվում են, և դրանք կչափվեն իրական ժամանակի մեքենայի միջոցով: SYBR Green-ը և Taqman-ը իրական ժամանակում PCR-ի ուժեղացման գործընթացը հայտնաբերելու կամ դիտելու երկու եղանակ են: Երկու մեթոդներն էլ վերահսկում են ուժեղացման գործընթացի առաջընթացը և իրական ժամանակում հաղորդում արտադրանքի քանակը:
Նկար 03. իրական ժամանակի PCR
Իրական ժամանակում PCR-ն ունի կիրառությունների լայն տեսականի, ինչպիսիք են գեների արտահայտման քանակականացումը, միկրոՌՆԹ-ի և ոչ կոդավորող ՌՆԹ-ի վերլուծությունը, SNP-ի գենոտիպավորումը, պատճենների թվի տարբերակների հայտնաբերումը, հազվագյուտ մուտացիաների հայտնաբերումը, գենետիկորեն ձևափոխված օրգանիզմների հայտնաբերումը և վարակիչ նյութերի հայտնաբերում.
Որո՞նք են նմանությունները սովորական Nested և իրական ժամանակի PCR վերլուծությունների միջև:
- Ներդրված և իրական ժամանակի PCR անալիզները սովորական PCR հետազոտության փոփոխություններն են:
- Բոլոր երեք տեխնիկան ուժեղացնում է ԴՆԹ-ի նմուշները:
- Նրանց արտադրանքը կարող է օգտագործվել հաջորդականության կամ վերլուծության մեջ:
- Այս անալիզները պահանջում են պրայմերներ։
Ո՞րն է տարբերությունը սովորական Nested և իրական ժամանակի PCR վերլուծությունների միջև:
Պայմանական PCR-ը տեխնիկա է, որը մշակվել է ԴՆԹ-ի որոշակի հաջորդականությունների ընդլայնման համար: Մինչդեռ Nested PCR-ը սովորական PCR-ի փոփոխություն է, որը բաղկացած է երկու հաջորդական ուժեղացման ռեակցիաներից, իսկ իրական ժամանակում PCR-ը սովորական PCR-ի տարբերակ է, որն ի վիճակի է քանակականացնել ուժեղացված արտադրանքը:Այսպիսով, սա հիմնական տարբերությունն է սովորական ներդիր և իրական ժամանակի PCR վերլուծությունների միջև: Ի տարբերություն սովորական և իրական ժամանակի PCR-ի, nested PCR-ն օգտագործում է երկու պրայմերների հավաքածու: Ավելին, ոչ սպեցիֆիկ ամպլիֆիկացիան նվազեցնելու համար կա երկու հաջորդական ամպլիֆիկացիոն ռեակցիաներ nested PCR-ում: Բացի այդ, սովորական և իրական ժամանակի PCR անալիզները չեն պարունակում երկու հաջորդական ուժեղացման ռեակցիաներ:
Հետևյալ ինֆոգրաֆիկայում թվարկվում են սովորական ներդիր և իրական ժամանակի PCR վերլուծությունների միջև եղած տարբերությունները աղյուսակային տեսքով՝ կողք կողքի համեմատելու համար:
Ամփոփում – Պայմանական vs Nested vs իրական ժամանակի PCR վերլուծություններ
Պայմանական PCR-ն առաջին տեխնիկան է, որը մշակվել է ԴՆԹ-ի հատուկ բեկորների ուժեղացման համար: Nested PCR և իրական ժամանակի PCR-ը սովորական PCR-ի երկու տարբերակ են: Գոյություն ունեն երկու հաջորդական ուժեղացման ռեակցիաներ և երկու այբբենարանների օգտագործումը ներդիր ՊՇՌ-ում: Իրական ժամանակի ՊՇՌ-ն մշակվել է ուժեղացված ՊՇՌ արտադրանքը քանակականացնելու համար: Այսպիսով, սա ամփոփում է սովորական ներդիր և իրական ժամանակի PCR վերլուծությունների միջև եղած տարբերությունը:
