Հիմնական տարբերություն – PCR ընդդեմ ԴՆԹ-ի հաջորդականության
PCR-ն և ԴՆԹ-ի հաջորդականությունը մոլեկուլային կենսաբանության երկու կարևոր տեխնիկա են: Պոլիմերազային շղթայական ռեակցիան (PCR) գործընթաց է, որը ստեղծում է ԴՆԹ-ի հատվածի մեծ թվով պատճեններ: ԴՆԹ-ի հաջորդականությունը այն տեխնիկան է, որը հանգեցնում է տվյալ ԴՆԹ-ի հատվածի նուկլեոտիդների ճշգրիտ հերթականությանը: Սա PCR-ի և ԴՆԹ-ի հաջորդականության հիմնական տարբերությունն է: PCR-ը ԴՆԹ-ի հաջորդականության մեջ ներգրավված հիմնական քայլերից մեկն է:
Ի՞նչ է PCR?
Պոլիմերազային շղթայական ռեակցիան (PCR) ԴՆԹ-ի ուժեղացման մեթոդ է, որն օգտագործվում է մոլեկուլային կենսաբանության մեջ: Այն արտադրում է ԴՆԹ-ի որոշակի հատվածի հազարավորից միլիոնավոր պատճեններ:Այս մեթոդը մշակվել է Կարի Մալիսի կողմից 1983թ.-ին: Այս տեխնիկայում ուժեղացվող ԴՆԹ-ի հատվածը ծառայում է որպես ձևանմուշ, և ԴՆԹ պոլիմերազային ֆերմենտը լրացուցիչ նուկլեոտիդներ է ավելացնում պրայմերին, որը հասանելի է PCR խառնուրդում: PCR ռեակցիայի վերջում սինթեզվում են նմուշի ԴՆԹ-ի բազմաթիվ պատճեններ:
ՊՇՌ խառնուրդի տարբեր բաղադրիչներ կան, այդ թվում՝ ԴՆԹ, ԴՆԹ պոլիմերազա (Taq պոլիմերազա), պրայմերներ (առաջ և հակադարձ պրայմերներ), նուկլեոտիդներ (ԴՆԹ-ի շինանյութեր) և բուֆեր: PCR-ն տեղի է ունենում PCR մեքենայի ներսում, և ճիշտ PCR խառնուրդը պետք է բեռնվի մեքենայի մեջ, և պետք է գործարկվի ճիշտ ծրագիրը: Այս տեխնիկան հնարավորություն է տալիս ԴՆԹ-ի որոշակի հատվածի հազարավորից միլիոնավոր պատճեններ արտադրել շատ փոքր քանակությամբ ԴՆԹ-ից:
PCR ռեակցիաները տեղի են ունենում ցիկլային ձևով, որպեսզի ստացվի գելի վրա տեսանելի քանակությամբ PCR արտադրանք: Գոյություն ունեն երեք հիմնական փուլեր, որոնք ներգրավված են PCR ռեակցիայի մեջ, այն է՝ դենատուրացիա, այբբենարանի եռացում և շղթայի երկարացում, ինչպես ցույց է տրված Նկար 01-ում:Այս երեք քայլերը տեղի են ունենում երեք տարբեր ջերմաստիճաններում: ԴՆԹ-ն գոյություն ունի կրկնակի շղթայական ձևով` կոմպլեմենտար հիմքերի միջև ջրածնային կապերով: Մինչ ենթադրությունը, երկշղթա ԴՆԹ-ն պետք է առանձնացվի միմյանցից: Դա արվում է բարձր ջերմաստիճան տալով։ Բարձր ջերմաստիճանի դեպքում կրկնակի շղթա ունեցող ԴՆԹ-ն վերածվում է միայնակ շղթաների: Այնուհետև այբբենարանները պետք է մոտենան կոնկրետ հատվածի կամ ԴՆԹ-ի գենի կողային ծայրերին: Primer-ը միաշղթա ԴՆԹ-ի կարճ կտոր է, որը լրացնում է թիրախային հաջորդականությունը: Առջևի և հետադարձ այբբենարանների հետ կռվում են դենատուրացված նմուշի ԴՆԹ-ի կողային ծայրերում գտնվող կոմպլեմենտար հիմքերը՝ եռացման ջերմաստիճանում: Այբբենարանները պետք է լինեն ջերմակայուն: Երբ այբբենարանները միանում են նմուշի ԴՆԹ-ին, taq պոլիմերազային ֆերմենտը սկսում է նոր շղթաների սինթեզը՝ ավելացնելով նուկլեոտիդներ, որոնք լրացնում են թիրախ ԴՆԹ-ին: Taq պոլիմերազը ջերմակայուն ֆերմենտ է, որը մեկուսացված է Thermus aquaticus կոչվող ջերմասեր բակտերիայից: PCR բուֆերը պահպանում է օպտիմալ պայմաններ taq պոլիմերազի գործողության համար:PCR ռեակցիաների այս երեք փուլերը կրկնվում են PCR արտադրանքի պահանջվող քանակությունը ստանալու համար: Յուրաքանչյուր PCR ռեակցիայից հետո ԴՆԹ-ի պատճենների թիվը կրկնապատկվում է: Հետևաբար, PCR-ում կարող է դիտվել էքսպոնենցիալ ուժեղացում: PCR արտադրանքները կարելի է դիտարկել գելային էլեկտրոֆորեզի միջոցով և կարող են զտվել հետագա ուսումնասիրությունների համար:
Նկար 01. PCR ռեակցիայի հիմնական քայլերը
PCR-ն արժեքավոր գործիք է բժշկական և կենսաբանական հետազոտություններում: PCR-ն հատուկ արժեք ունի դատաբժշկական գիտության մեջ, քանի որ այն կարող է ուժեղացնել ԴՆԹ-ն հանցագործների փոքրիկ նմուշների ուսումնասիրությունների համար և կազմել դատաբժշկական ԴՆԹ պրոֆիլներ: PCR-ն լայնորեն կիրառվում է մոլեկուլային կենսաբանության բազմաթիվ ոլորտներում, ներառյալ՝ գենոտիպավորում, գեների կլոնավորում, մուտացիաների հայտնաբերում, ԴՆԹ-ի հաջորդականություն, ԴՆԹ միկրոզանգվածներ և հայրության թեստավորում և այլն:
Նկար 02. պոլիմերազային շղթայական ռեակցիա
Ի՞նչ է ԴՆԹ-ի հաջորդականությունը:
ԴՆԹ-ի հաջորդականությունը նուկլեոտիդների՝ ադենին, գուանին, ցիտոզին և թիմին տրված ԴՆԹ հատվածի ճշգրիտ կարգի որոշումն է: Գենետիկական տեղեկատվությունը պահվում է ԴՆԹ-ի հաջորդականություններում՝ օգտագործելով նուկլեոտիդների ճիշտ հերթականությունը: Հետևաբար, ԴՆԹ-ի հատվածում նուկլեոտիդների ճշգրիտ կարգը գտնելը շատ կարևոր է իմանալ գեների կառուցվածքի և գործառույթի մասին:
ԴՆԹ-ի հաջորդականության արձանագրությունը ներառում է տարբեր գործընթացներ: Առաջին քայլը հետաքրքրված ԴՆԹ-ի կամ օրգանիզմի գենոմային ԴՆԹ-ի մեկուսացումն է: Օգտագործելով PCR (ինչպես նկարագրված է վերևում) ԴՆԹ-ի ցանկալի հատվածը պետք է ուժեղացվի: Amplified PCR արտադրանքը պետք է առանձնացվի գելային էլեկտրոֆորեզով և մաքրվի: Ընդլայնված բեկորները ծառայում են որպես հաջորդականության կաղապարներ:Հերթականությունը կարող է իրականացվել կամ ըստ Sanger հաջորդականության կամ բարձր թողունակության հաջորդականության մեթոդի: Sanger հաջորդականությունը պահանջում է ստացված ԴՆԹ-ի բեկորների մազանոթային էլեկտրոֆորեզ: Նուկլեոտիդների ճիշտ կարգի որոշումը կարող է իրականացվել ավտոռադիոգրաֆների ձեռքով ընթերցմամբ կամ ԴՆԹ-ի ավտոմատացված հաջորդականիչների միջոցով:
Գենի հաջորդականությունը նպաստեց Մարդու գենոմի նախագծին և հեշտացրեց մարդու գենոմի քարտեզագրումը 2003 թվականին: Դատաբժշկական փորձագիտությունում ԴՆԹ-ի հաջորդականությունը հնարավորություն տվեց նույնականացնել այն անհատներին, որոնք ցույց են տալիս ԴՆԹ-ի եզակի հաջորդականությունը և նույնացնում հանցագործներին: Բժշկության մեջ ԴՆԹ-ի հաջորդականությունը կարող է օգտագործվել գենետիկական և այլ հիվանդությունների համար պատասխանատու գեները հայտնաբերելու, արատների գեները գտնելու և դրանք ճիշտ գեներով փոխարինելու համար։ Գյուղատնտեսության մեջ որոշ միկրոօրգանիզմների ԴՆԹ-ի հաջորդականության տեղեկատվությունը օգտագործվում է տնտեսապես ցանկալի բնութագրերով տրանսգենային մշակաբույսերի արտադրության համար:
Նկար 03. ԴՆԹ-ի հաջորդականություն
Ո՞րն է տարբերությունը PCR-ի և ԴՆԹ-ի հաջորդականության միջև:
PCR ընդդեմ ԴՆԹ-ի հաջորդականության |
|
| PCR գործընթացը ստեղծում է հետաքրքրված ԴՆԹ-ի հատվածի հազարավորից միլիոնավոր պատճեններ: | ԴՆԹ-ի հաջորդականությունը տվյալ ԴՆԹ-ի հատվածում նուկլեոտիդների ճշգրիտ կարգի որոշման գործընթացն է: |
| Արդյունք | |
| PCR-ն ստեղծում է ԴՆԹ-ի որոշակի հատվածի հազարավորից միլիոնավոր պատճեններ | Սա հանգեցնում է ԴՆԹ-ի որոշակի հատվածի հիմքերի ճիշտ հերթականությանը: |
| ddNTP-ների ներգրավում | |
| PCR-ը չի պահանջում ddNTP-ներ: Այն օգտագործում է dNTP: | ԴՆԹ-ի հաջորդականությունը պահանջում է ddNTPs՝ շղթայի ձևավորումը դադարեցնելու համար: |
Ամփոփում – PCR ընդդեմ ԴՆԹ-ի հաջորդականության
PCR-ն և ԴՆԹ-ի հաջորդականությունը շատ կարևոր գործիքներ են մոլեկուլային կենսաբանության շատ ոլորտներում: ԴՆԹ-ի բեկորների ուժեղացումը կատարվում է PCR տեխնիկայով, մինչդեռ ԴՆԹ-ի հատվածի նուկլեոտիդների ճիշտ կարգը որոշվում է ԴՆԹ-ի հաջորդականությամբ: Սա է տարբերությունը PCR-ի և ԴՆԹ-ի հաջորդականության միջև:
