Գոլդեն Գեյթի և Գիբսոնի ասամբլեայի հիմնական տարբերությունն այն է, որ Golden Gate-ը հիմնված է կլոնավորման որոշակի հաջորդականության մեջ սահմանափակման վայրերի առկայության վրա, մինչդեռ Գիբսոնի ասամբլեան չի հիմնվում սահմանափակման վայրերի առկայության վրա որոշակի հաջորդականության մեջ: կլոնավորվի։
Վերջին տասնամյակների ընթացքում մոլեկուլային գիտնականները մշակել են տարբեր ստանդարտացված ընթացակարգեր, որոնք թույլ են տալիս ավելի հեշտ հավաքել ԴՆԹ-ի բազմաթիվ բեկորները մեկ կտորի մեջ: Հետևաբար, կլոնավորման մեթոդները, ինչպիսիք են Restriction Enzyme Ligation, Gateway Cloning, Gibson Assembly, Golden Gate Assembly և TOPO Cloning, լայնորեն օգտագործվում են հետազոտողների կողմից գիտափորձերում:Հետևաբար, Golden Gate-ը և Gibson Assembly-ը երկու մոլեկուլային կլոնավորման մեթոդներ են, որոնք թույլ են տալիս հավաքել ԴՆԹ-ի բազմաթիվ բեկորներ մեկ կտորի մեջ:
Ի՞նչ է Golden Gate համագումարը:
Golden Gate-ը մոլեկուլային կլոնավորման մեթոդ է, որը հեշտացնում է ԴՆԹ-ի բազմաթիվ բեկորների հավաքումը մեկ կտորի մեջ: Այս մեթոդը հիմնված է կլոնավորվող որոշակի հաջորդականության մեջ սահմանափակման վայրերի առկայության վրա: Այն առաջացել է 1996 թվականին: Այս տեխնիկան օգտագործում է Type IIS սահմանափակող ֆերմենտներ և T4 ԴՆԹ լիգազ: Այս ֆերմենտները կտրում են ԴՆԹ-ն ճանաչման վայրերից դուրս: Նրանք կարող են ստեղծել ոչ պալինդրոմային ելուստներ։ Հետևաբար, ԴՆԹ-ի մի քանի բեկորներ կարող են հավաքվել՝ օգտագործելով վերելքի հաջորդականությունների համակցությունները:
Նկար 01. Ոսկե դարպաս
Գոլդեն Գեյթի հավաքման կարգ
Golden Gate տեխնիկան իր ընթացակարգում ունի հիմնական երեք քայլ.
- կլոնավորման վեկտորում վերելակների ստեղծում,
- մի քանի ԴՆԹ ներդիրների հավաքում` օգտագործելով բեկորային հատուկ հաջորդականությունները գերածանցներում, և
- լիգացիա.
Գոլդեն Գեյթի հավաքում օգտագործվում են շրջանաձև կլոնավորման վեկտորներ (նպատակակետային վեկտոր): Ավելին, այս մեթոդով սահմանափակման տեղանքը վերացվում է կապակցված արտադրանքից՝ մարսողությունը և կապումը միաժամանակ իրականացնելու համար: Տիպիկ ջերմային ցիկլի արձանագրությունը Golden Gate-ի համար տատանվում է 37 °C-ից մինչև 16 °C, քանի որ 37 °C-ը օպտիմալ է սահմանափակող ֆերմենտների համար, իսկ 16 °C-ը` լիգաների համար::
Ի՞նչ է Գիբսոնի ժողովը:
Գիբսոնի հավաքումը մոլեկուլային կլոնավորման մեթոդ է, որը թույլ է տալիս մի քանի ԴՆԹ բեկորներ հավաքել մեկ կտորի մեջ: Ի տարբերություն Golden Gate մեթոդի, այս մեթոդը չի հիմնվում կլոնավորման որոշակի հաջորդականության մեջ սահմանափակման վայրերի առկայության վրա:Այն գտել է J. Craig Venter ինստիտուտի Դանիել Գիբսոնը: Այս տեխնիկան հաջորդականության և լիգազի անկախ կլոնավորման (SLIC) մեթոդի տեսակ է:
Նկար 02. Գիբսոնի ժողով
Գիբսոնի հավաքման կարգ
Գիբսոնի ասամբլեային անհրաժեշտ են ԴՆԹ-ի բեկորներ, որոնք պարունակում են 20-40 բազային զույգ, որոնք համընկնում են հարակից ԴՆԹ-ի բեկորների հետ: Համընկնումները ավելացվում են PCR-ի միջոցով: Այնուհետև ԴՆԹ-ի այս բեկորները ավելացվում են Gibson maser խառնուրդին, որն ունի երեք ֆերմենտ: Այս պրոցեդուրան իրականացվում է իզոթերմային պայմաններում (50 °C 1 ժամվա ընթացքում)՝ օգտագործելով երեք տարբեր ֆերմենտներ՝ էկզոնուկլեազ, ԴՆԹ պոլիմերազ և ԴՆԹ լիգազ։ Էկզոնուկլեազը հետ է ծամում ԴՆԹ-ն 5-րդ ծայրից: Այսպիսով, այն չի արգելակում պոլիմերազային ակտիվությունը և թույլ չի տալիս ռեակցիան շարունակել մեկ գործընթացում:Արդյունքում առաջացած միաշղթա շրջանները հարակից ԴՆԹ-ի բեկորների վրա կարող են զտվել համընկնման հաջորդականությունների պատճառով: ԴՆԹ պոլիմերազը լրացնում է բացերը՝ ավելացնելով նուկլեոտիդներ։ Վերջապես, ԴՆԹ-ի լիգազան կովալենտորեն միանում է հարակից հատվածների ԴՆԹ-ին: Սովորաբար Գիբսոնի ժողովը օգտագործում է գծային նշանակման վեկտորներ: Ավելին, այս մեթոդը կարող է միաժամանակ միավորել մինչև 15 ԴՆԹ բեկորներ՝ հաջորդականության նմանության հիման վրա։
Նմանություններ Գոլդեն Գեյթի և Գիբսոնի ասամբլեայի միջև
- Golden Gate-ը և Gibson Assembly-ը երկու մոլեկուլային կլոնավորման մեթոդներ են:
- Երկու մեթոդներն էլ կարող են մի քանի ԴՆԹ բեկորներ հավաքել մեկ կտորի մեջ:
- Այս մեթոդները օգտագործում են նպատակակետ վեկտորներ:
- Երկու մեթոդներն էլ օգտագործում են ջերմային ցիկլեր ԴՆԹ-ի բազմաթիվ բեկորների հավաքման համար:
- Դրանք օգտագործվում են տեղամասային մուտագենեզում:
Տարբերությունը Golden Gate-ի և Gibson-ի միջև
Golden Gate-ը մոլեկուլային կլոնավորման մեթոդ է, որն օգտագործվում է ԴՆԹ-ի բազմաթիվ բեկորները մեկ կտորի մեջ հավաքելու համար՝ հենվելով կլոնավորվող որոշակի հաջորդականության մեջ սահմանափակող վայրերի առկայության վրա, մինչդեռ Գիբսոնի ժողովը մոլեկուլային կլոնավորման մեթոդ է, որն օգտագործվում է ԴՆԹ-ի մի քանի բեկորների հավաքում մեկ կտորի մեջ՝ առանց հենվելու կլոնավորվող որոշակի հաջորդականության մեջ սահմանափակող վայրերի առկայության վրա:Սա հիմնական տարբերությունն է Golden Gate-ի և Gibson Assembly-ի միջև: Ավելին, Golden Gate մեթոդը օգտագործում է շրջանաձև նպատակակետ վեկտոր, մինչդեռ Gibson Assembly մեթոդը օգտագործում է գծային նպատակակետերի վեկտոր:
Հետևյալ ինֆոգրաֆիկան ցույց է տալիս տարբերությունը Golden Gate-ի և Gibson Assembly-ի միջև:
Ամփոփում – Golden Gate vs Gibson Assembly
Մոլեկուլային կլոնավորումը մեթոդ է, որն օգտագործվում է ԴՆԹ-ի ռեկոմբինանտ մոլեկուլները հավաքելու և դրանց վերարտադրությունը հյուրընկալող օրգանիզմներում ուղղորդելու համար: Golden Gate-ը և Gibson Assembly-ը երկու մոլեկուլային կլոնավորման մեթոդներ են, որոնք թույլ են տալիս մի քանի ԴՆԹ-ի բեկորներ հավաքել մեկ կտորի մեջ: Golden Gate մեթոդը հիմնված է կլոնավորվող որոշակի հաջորդականության մեջ սահմանափակման վայրերի առկայության վրա, մինչդեռ Gibson Assembly-ը չի հիմնվում կլոնավորման որոշակի հաջորդականության մեջ սահմանափակման վայրերի առկայության վրա: Այսպիսով, սա հիմնական տարբերությունն է Golden Gate-ի և Gibson Assembly-ի միջև:
