CRISPR-ի և սահմանափակող ֆերմենտների միջև հիմնական տարբերությունն այն է, որ CRISPR-ը բնական պրոկարիոտային իմունային պաշտպանության մեխանիզմ է, որը վերջերս օգտագործվել է էուկարիոտ գեների խմբագրման և փոփոխման համար, մինչդեռ սահմանափակող ֆերմենտները կենսաբանական մկրատ են, որոնք ԴՆԹ-ի մոլեկուլները բաժանում են ավելի փոքր նյութերի:
Գենոմի խմբագրումը և գենային ձևափոխումը հետաքրքիր և նորարարական ոլորտներ են գենետիկայի և մոլեկուլային կենսաբանության մեջ: Գենային թերապիայի ուսումնասիրությունները լայնորեն օգտագործում են գենային մոդիֆիկացիան: Ավելին, գենի մոդիֆիկացիան օգտակար է գենի հատկությունները, գենի ֆունկցիոնալությունը և ինչպես կարող են գենի մուտացիաները ազդել նրա ֆունկցիայի վրա ազդելու համար:Կարևոր է գտնել կենդանի բջիջների գենոմում ճշգրիտ, նպատակային փոփոխություններ կատարելու արդյունավետ և հուսալի եղանակներ: CRISPR-ը և սահմանափակումային ֆերմենտները առանցքային դեր են խաղում գենային մոդիֆիկացիաներում: CRISPR-ը բարձր ճշգրտությամբ փոփոխում է գեները: Սահմանափակող ֆերմենտները գործում են որպես կենսաբանական մկրատ, որոնք ԴՆԹ-ի մոլեկուլները բաժանում են ավելի փոքր նյութերի:
Ի՞նչ է CRISPR-ը:
CRISPR համակարգը բնական մեխանիզմ է, որը առկա է որոշ բակտերիաներում, ներառյալ E. coli-ն և Archea-ն: Սա հարմարվողական իմունային պաշտպանություն է օտարերկրյա ԴՆԹ-ի վրա հիմնված ներխուժումների դեմ: Ավելին, դա հաջորդականության հատուկ մեխանիզմ է։ CRISPR համակարգը պարունակում է մի քանի ԴՆԹ կրկնվող տարրեր: Այս տարրերը ցրված են օտար ԴՆԹ-ից և բազմաթիվ Cas գեներից ստացված կարճ «spacer» հաջորդականություններով: Cas գեներից մի քանիսը նուկլեազներ են։ Այսպիսով, ամբողջական իմունային համակարգը կոչվում է CRISPR/Cas համակարգ:
CRISPR/Cas համակարգը գործում է չորս քայլով.
- Համակարգը գենետիկորեն կապում է ներխուժող ֆագերի և պլազմիդի ԴՆԹ-ի հատվածները (տարածիչներ) դեպի CRISPR տեղորոշիչներ (կոչվում է spacer ձեռքբերման քայլ):
- crRNA-ի հասունացման քայլ – հյուրընկալողը տառադարձում և մշակում է CRISPR տեղորոշիչները՝ գեներացնելու հասուն CRISPR ՌՆԹ (crRNA), որը պարունակում է ինչպես CRISPR կրկնվող տարրեր, այնպես էլ ինտեգրված spacer տարր:
- CrRNA-ն հայտնաբերում է հոմոլոգ ԴՆԹ-ի հաջորդականությունները՝ լրացուցիչ հիմքերի զուգակցման միջոցով: Սա կարևոր է, երբ առկա է վարակ և առկա է վարակիչ:
- Թիրախային միջամտության քայլ – crRNA-ն հայտնաբերում է օտար ԴՆԹ-ն, բարդույթ է կազմում օտար ԴՆԹ-ի հետ և պաշտպանում հյուրընկալողին օտար ԴՆԹ-ից:
Ներկայումս CRISPR/Cas9 համակարգը օգտագործվում է կաթնասունների գենոմը փոխելու կամ փոփոխելու համար՝ կա՛մ արտագրման ռեպրեսիայի, կա՛մ ակտիվացման միջոցով: Կաթնասունների բջիջները կարող են արձագանքել CRISPR/Cas9 միջնորդավորված ԴՆԹ-ի կոտրվածքներին՝ կիրառելով վերականգնման մեխանիզմ:Այն կարող է իրականացվել կամ օգտագործելով ոչ հոմոլոգ վերջի միացման մեթոդը (NHEJ) կամ հոմոլոգիայի ուղղորդված վերանորոգումը (HDR): Վերանորոգման այս երկու մեխանիզմներն էլ տեղի են ունենում կրկնակի շղթայական ընդմիջումների ներդրմամբ: Սա հանգեցնում է կաթնասունների գեների խմբագրմանը: NHEJ-ը կարող է հանգեցնել գենային մուտացիաների աբլյացիայի և կարող է օգտագործվել ֆունկցիոնալ էֆեկտների կորստի համար: HDR-ը կարող է օգտագործվել կոնկրետ կետային մուտացիաներ ներմուծելու կամ տարբեր երկարությամբ ԴՆԹ հատվածներ ներմուծելու համար: Ներկայումս CRISPR/ Cas համակարգը օգտագործվում է թերապևտիկ, կենսաբժշկական, գյուղատնտեսական և հետազոտական կիրառությունների ոլորտներում:
Ի՞նչ են սահմանափակող ֆերմենտները:
Սահմանափակող ֆերմենտը, որն ավելի հաճախ կոչվում է սահմանափակող էնդոնուկլեազ, ունի ԴՆԹ մոլեկուլները փոքր բեկորների բաժանելու հատկություն: Ճեղքման գործընթացը տեղի է ունենում ԴՆԹ-ի մոլեկուլի ճանաչման հատուկ վայրի մոտ կամ դրա մոտ, որը կոչվում է սահմանափակման տեղ: Ճանաչման կայքը սովորաբար կազմված է 4-8 բազային զույգերից: Կախված պառակտման վայրից, սահմանափակող ֆերմենտները կարող են լինել չորս (04) տարբեր տեսակների` տիպ I, տիպ II, տիպ III և տիպ IV:Բացի ճեղքման վայրից, սահմանափակող ֆերմենտները չորս խմբերի տարբերակելիս հաշվի են առնվում այնպիսի գործոններ, ինչպիսիք են կազմը, համագործոնների պահանջը և թիրախային հաջորդականության վիճակը:
ԴՆԹ-ի մոլեկուլների տրոհման ժամանակ ճեղքման վայրը կարող է լինել կա՛մ սահմանափակման վայրում, կա՛մ սահմանափակման վայրից հեռավորության վրա: Սահմանափակող ֆերմենտները ստեղծում են երկու կտրվածք ԴՆԹ-ի կրկնակի պարույրի շաքարաֆոսֆատային ողնաշարի միջով:
Գծապատկեր 02. Սահմանափակող ֆերմենտներ
Սահմանափակող ֆերմենտները հիմնականում հանդիպում են աքեայում և բակտերիաներում: Նրանք օգտագործում են այս ֆերմենտները որպես պաշտպանական մեխանիզմ ներխուժող վիրուսների դեմ: Սահմանափակող ֆերմենտները կտրում են օտար (պաթոգեն) ԴՆԹ-ն, բայց ոչ իրենց սեփական ԴՆԹ-ն:Նրանց սեփական ԴՆԹ-ն պաշտպանված է մի ֆերմենտով, որը հայտնի է որպես մեթիլտրանսֆերազ, որը փոփոխություններ է կատարում հյուրընկալող ԴՆԹ-ում և կանխում է պառակտումը։
I տիպի սահմանափակող ֆերմենտը ունի ճեղքման տեղ, որը հեռու է ճանաչման վայրից: Ֆերմենտի աշխատանքի համար պահանջվում է ATP և սպիտակուց՝ S-adenosil-L-methionine: I տիպի սահմանափակող ֆերմենտը համարվում է բազմաֆունկցիոնալ և՛ սահմանափակման, և՛ մեթիլազային ակտիվության առկայության պատճառով: II տիպի սահմանափակող ֆերմենտները ճեղքվում են ճանաչման վայրում կամ ավելի մոտ հեռավորության վրա: Իր գործունեության համար անհրաժեշտ է միայն մագնեզիում (Mg): II տիպի սահմանափակող ֆերմենտներն ունեն միայն մեկ ֆունկցիա և անկախ են մեթիլազից:
Որո՞նք են նմանությունները CRISPR-ի և սահմանափակող ֆերմենտների միջև:
- CRISPR-ը և սահմանափակող ֆերմենտները կարևոր գործիքներ են գեների ձևափոխման գործում:
- CRISPR-ի կամ Cas9-ի և սահմանափակող ֆերմենտների մի մասը էնդոնուկլեազներն են:
- Երկուսն էլ կարող են ճանաչել բնորոշ ԴՆԹ-ի հաջորդականությունները և ճեղքել ԴՆԹ:
- Նրանք առկա են բակտերիաներում և արխեաներում:
- Եվ CRISPR-ը և սահմանափակող ֆերմենտները հատուկ են հաջորդականությանը:
Ո՞րն է տարբերությունը CRISPR-ի և սահմանափակող ֆերմենտների միջև:
CRISPR-Cas համակարգը պրոկարիոտային իմունային համակարգ է, որը դիմադրություն է հաղորդում օտար գենետիկ տարրերին: Մյուս կողմից, սահմանափակող ֆերմենտները էնդոնուկլեազներ են, որոնք ճանաչում են նուկլեոտիդների որոշակի հաջորդականություն և առաջացնում են ԴՆԹ-ի կրկնակի շղթա կտրվածք: Այսպիսով, սա է հիմնական տարբերությունը CRISPR-ի և սահմանափակող ֆերմենտների միջև:
Ավելին, CRISPR-ը թույլ է տալիս չափազանց ճշգրիտ կտրվածքներ: Դրա համեմատ, սահմանափակող ֆերմենտի ճեղքումը ավելի քիչ ճշգրիտ է: Ավելին, CRISPR-ը առաջադեմ տեխնիկա է, մինչդեռ սահմանափակող ֆերմենտները պարզունակ են:
Ստորև ինֆոգրաֆիկայում ամփոփված է CRISPR-ի և սահմանափակող ֆերմենտների միջև եղած տարբերությունը:
Ամփոփում – CRISPR ընդդեմ սահմանափակող ֆերմենտների
CRISPR-ը և սահմանափակող ֆերմենտները գենային մոդիֆիկացիայի մեջ օգտագործվող երկու տեսակի տեխնիկա են: CRISPR-ը հարմարվողական իմունային պաշտպանություն է, որն իրականացվում է որոշ բակտերիաներում օտարերկրյա ԴՆԹ-ի վրա հիմնված ներխուժումների դեմ: Դա բնական պաշտպանական մեխանիզմ է։ Ի հակադրություն, սահմանափակող ֆերմենտները էնդոնուկլեազներ են, որոնք ճեղքում են երկշղթա ԴՆԹ: Ե՛վ CRISPR-ը, և՛ սահմանափակող ֆերմենտները կարողանում են ԴՆԹ-ն կտրել փոքր հատվածների: Այնուամենայնիվ, երկուսն էլ հատուկ են հաջորդականությանը: CRISPR-ի համեմատ սահմանափակող ֆերմենտները պարզունակ են: CRISPR-ը թույլ է տալիս չափազանց ճշգրիտ կտրվածքներ, քան սահմանափակող ֆերմենտները: Այսպիսով, սա CRISPR-ի և սահմանափակող ֆերմենտների միջև եղած տարբերության ամփոփումն է:
