Հիմնական տարբերություն – Հյուսիսային ընդդեմ հարավի ընդդեմ արևմտյան բլոթինգ
ԴՆԹ-ի, ՌՆԹ-ի և սպիտակուցների հատուկ հաջորդականությունների հայտնաբերումը կարևոր է մոլեկուլային կենսաբանության տարբեր տեսակի ուսումնասիրությունների համար: Գելային էլեկտրոֆորեզը մեթոդ է, որը բաժանում է ԴՆԹ, ՌՆԹ և սպիտակուցներ՝ ըստ դրանց չափերի: Գելի պրոֆիլներից ԴՆԹ-ի որոշակի հաջորդականությունը, ՌՆԹ-ի հաջորդականությունը կամ սպիտակուցը հայտնաբերվում են հատուկ տեխնիկայի միջոցով, որը կոչվում է բլոտավորում և հիբրիդացում պիտակավորված զոնդերով: Գոյություն ունեն երեք տարբեր տեսակի մաքրման մեթոդներ՝ հարավային, հյուսիսային և արևմտյան: Հյուսիսային հարավային և արևմտյան բլոթի միջև հիմնական տարբերությունը կայանում է նրանում, թե ինչպիսի մոլեկուլ է այն հայտնաբերում նմուշից:Southern blotting-ը մեթոդ է, որը հայտնաբերում է ԴՆԹ-ի որոշակի հաջորդականություն ԴՆԹ-ի նմուշից: Հյուսիսային blotting-ը տեխնիկա է, որը հայտնաբերում է ՌՆԹ-ի որոշակի հաջորդականություն ՌՆԹ-ի նմուշից: Western blotting-ը մեթոդ է, որը հայտնաբերում է հատուկ սպիտակուցը սպիտակուցի նմուշից:
Ի՞նչ է Southern Blotting-ը:
Southern blotting տեխնիկան մշակվել է E. M. Southern-ի կողմից 1975 թվականին՝ ԴՆԹ-ի նմուշից որոշակի ԴՆԹ հաջորդականության նույնականացման համար: Սա մոլեկուլային կենսաբանության մեջ ներդրված բլոտինգի առաջին տեխնիկան է: Այն հնարավորություն է տվել հայտնաբերել ԴՆԹ-ից հատուկ գեներ, ԴՆԹ-ից հատուկ բեկորներ և այլն: Սաութերն բլոտինգի տեխնիկան մի քանի քայլ է ներառում: Դրանք հետևյալն են.
- ԴՆԹ-ն մեկուսացված է նմուշից և մարսվում է սահմանափակող էնդոնուկլեազներով:
- Մարսված նմուշն առանձնացվում է Ագարոզա գելի էլեկտրոֆորեզով:
- Գելի մեջ ԴՆԹ-ի բեկորները վերածվում են մեկ թելերի՝ օգտագործելով ալկալային լուծույթ:
- Միաշղթա ԴՆԹ-ն տեղափոխվում է նիտրոցելյուլոզային ֆիլտրի թաղանթ մազանոթային փոխանցման միջոցով:
- Տեղափոխված ԴՆԹ-ն մշտապես ամրացվում է թաղանթի վրա:
- Մեմբրանի վրա ամրացված ԴՆԹ-ն հիբրիդացված է պիտակավորված զոնդերով:
- Չկապված ԴՆԹ-ն լվացվում է թաղանթից:
- Ռենտգեն ֆիլմը ենթարկվում է թաղանթին և պատրաստվում է ավտոռադիոգրաֆիկ:
Հարավային բլոթը կիրառվում է մոլեկուլային կենսաբանության տարբեր ասպեկտների համար: Այն օգտակար է RFLP քարտեզագրման, դատաբժշկական հետազոտությունների, գեների արտահայտման մեջ ԴՆԹ-ի մեթիլացման, գենետիկ խանգարումների ժամանակ մուտացված գեների հայտնաբերման, ԴՆԹ մատնահետքերի և այլնի համար:
Գծապատկեր 01. Հարավային բծերի տեխնիկա
Ի՞նչ է Հյուսիսային բլոտինգը:
Northern blotting-ը մեթոդ է, որը նախատեսված է նմուշից ՌՆԹ-ի որոշակի հաջորդականությունը կամ mRNA հաջորդականությունը հայտնաբերելու համար՝ գեների էքսպրեսիան ուսումնասիրելու համար: Այս տեխնիկան մշակվել է Alwine-ի, Kemp-ի և Stark-ի կողմից 1979թ.-ին: Այն տարբերվում է հարավային և վեսթերն բլոտինգի տեխնիկայից մի քանի քայլերի շնորհիվ: Այնուամենայնիվ, այս տեխնիկան իրականացվում է նաև գելային էլեկտրոֆորեզի, բլոտինգի և հիբրիդացման միջոցով՝ հատուկ պիտակավորված զոնդերով և հայտնաբերմամբ: Հյուսիսային բլոտինգի տեխնիկան կատարվում է հետևյալ կերպ.
- ՌՆԹ-ն հանվում է նմուշից և առանձնացվում գելային էլեկտրոֆորեզով:
- ՌՆԹ-ն գելից տեղափոխվում է բլոտող թաղանթի վրա և ամրացվում:
- Մեմբրանը մշակվում է cDNA-ից կամ ՌՆԹ-ից պատրաստված պիտակավորված զոնդով (զոնդը լրացնում է նմուշի որոշակի հաջորդականությունը):
- Զոնդը ինկուբացվում է թաղանթով, որպեսզի կապվի որոշակի հաջորդականությամբ:
- Չկապված զոնդերը լվացվում են:
- Հիբրիդացված բեկորները հայտնաբերվում են ավտոռադիոգրաֆի միջոցով:
Northern blotting-ը կարևոր գործիք է հիբրիդացված mRNA-ի հայտնաբերման և քանակականացման, ՌՆԹ-ի դեգրադացիայի ուսումնասիրման, ՌՆԹ-ի կիսամյակի գնահատման, ՌՆԹ-ի միացման հայտնաբերման, գեների արտահայտման ուսումնասիրության և այլնի համար:
Գծապատկեր 02. Հյուսիսային բլթինգ
Ի՞նչ է Western Blotting-ը:
Western blotting-ը սպիտակուցային խառնուրդից հատուկ սպիտակուցի հայտնաբերման մեթոդ է պիտակավորված հակամարմինների միջոցով: Հետևաբար, western blot-ը հայտնի է նաև որպես իմունոբլոտ: Այս տեխնիկան ներդրվել է Towbin et al-ի կողմից 1979 թվականին և այժմ այն սովորաբար իրականացվում է լաբորատորիաներում՝ սպիտակուցի վերլուծության համար: Քայլերը հետևյալն են.
- Սպիտակուցներն արդյունահանվում են նմուշից
- Սպիտակուցները բաժանվում են ըստ իրենց չափերի՝ օգտագործելով պոլիակրիլամիդ գելային էլեկտրոֆորեզ
- Առանձնացված մոլեկուլները տեղափոխվում են PVDF թաղանթ կամ նիտրոցելյուլոզային թաղանթ՝ էլեկտրապորացիայի միջոցով
- Թաղանթն արգելափակված է հակամարմինների հետ ոչ սպեցիֆիկ կապվելու համար
- Տեղափոխված սպիտակուցները կապված են առաջնային հակամարմինների հետ (ֆերմենտային պիտակավորված հակամարմիններ):
- Թաղանթը լվանում են ոչ հատուկ կապված առաջնային հակամարմինները հեռացնելու համար
- Կապված հակամարմինները հայտնաբերվում են՝ ավելացնելով ենթաշերտը և հայտնաբերելով գոյացած գունավոր նստվածքը
Western blotting-ը օգտակար է մարդու շիճուկի նմուշում ՄԻԱՎ-ի դեմ հակամարմինների հայտնաբերման համար: Western blot-ը կարող է օգտագործվել նաև որպես հեպատիտ B-ի վարակի հաստատող թեստ և խելագար կովի հիվանդության վերջնական թեստ:
Գծապատկեր 03. Western Blotting
Ո՞րն է տարբերությունը հյուսիսային հարավային և արևմտյան բլոտինգի միջև:
Հյուսիսային ընդդեմ հարավային ընդդեմ արևմտյան բլոթինգ |
|
| Հայտնաբերվել է մոլեկուլի տեսակ | |
| Northern Blotting | Northern blotting-ը հայտնաբերում է ՌՆԹ-ի որոշակի հաջորդականություն ՌՆԹ-ի նմուշից: |
| Southern Blotting | Southern blotting-ը հայտնաբերում է ԴՆԹ-ի որոշակի հաջորդականություն ԴՆԹ-ի նմուշից: |
| Western Blotting | Western blotting-ը սպիտակուցի նմուշից հայտնաբերում է հատուկ սպիտակուց: |
| Գելի տեսակ | |
| Northern Blotting | Սա օգտագործում է Ագարոզա/ֆորմալդեհիդ գել: |
| Southern Blotting | Սա օգտագործում է Agarose գել: |
| Western Blotting | Սա օգտագործում է պոլիակրիլամիդ գել: |
| Բլոտի մեթոդ | |
| Northern Blotting | Սա մազանոթային փոխանցում է։ |
| Southern Blotting | Սա մազանոթային փոխանցում է։ |
| Western Blotting | Սա էլեկտրական փոխանցում է։ |
| Օգտագործված զոնդերը | |
| Northern Blotting | cDNA կամ RNA զոնդեր, որոնք պիտակավորված են ռադիոակտիվ կամ ոչ ռադիոակտիվ կերպով: |
| Southern Blotting | ԴՆԹ-ի զոնդերը պիտակավորված են ռադիոակտիվ կամ ոչ ռադիոակտիվ կերպով: |
| Western Blotting | Առաջնային հակամարմինները օգտագործվում են որպես զոնդ: |
| Հայտնաբերման համակարգ | |
| Northern Blotting | Սա արվում է ավտոռադիոգրաֆով կամ լույսի կամ գույնի փոփոխության հայտնաբերմամբ: |
| Southern Blotting | Սա արվում է ավտոռադիոգրաֆով, լույսի կամ գույնի փոփոխության հայտնաբերմամբ: |
| Western Blotting | Սա արվում է լույսի կամ գույնի փոփոխության հայտնաբերման միջոցով: |
Ամփոփում – Հյուսիսային ընդդեմ Հարավային ընդդեմ Արևմտյան Բլոտինգ
Բլոտինգը հատուկ տեխնիկա է, որը մշակվել է նմուշներից հատուկ ԴՆԹ-ի, ՌՆԹ-ի կամ սպիտակուցի նույնականացման համար:Գոյություն ունեն երեք առանձին բլոտման պրոցեդուրաներ՝ հյուսիսային, հարավային և արևմտյան՝ որոշակի տեսակի մոլեկուլ հայտնաբերելու համար: Northern blotting տեխնիկան նախատեսված է ՌՆԹ-ի խառնուրդից ՌՆԹ-ի որոշակի հաջորդականություն հայտնաբերելու համար: Southern blotting տեխնիկան հնարավորություն է տալիս հայտնաբերել ԴՆԹ-ի որոշակի հաջորդականություն ԴՆԹ-ի նմուշից, իսկ Western blotting տեխնիկան մշակվել է սպիտակուցային խառնուրդից հատուկ սպիտակուցը նույնականացնելու համար:
